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    公开号:WO1991003490A1
    申请号:PCT/JP1990/001135
    申请日:1990-09-05
    公开日:1991-03-21
    发明作者:Hidekazu Suginaka；Motoyuki Sugai；Yonman Hon；Hideo Ogai
    申请人:Earth Chemical Co., Ltd.；
    IPC主号:C12N9-00
    专利说明:
    [0001] 明 細 書
    [0002] ポ リべプチ ド及びその製造方法並びに該ポリ ペプチ ドを含有する医薬組成物及び化粧料 '
    [0003] 産業上の利用分野
    [0004] 本発明は新規なポリベプチ ド及びその製造方法、 該ポリ ぺプチ ドを含有する医薬組成物及び化粧料並びに該ポリぺ プチ ドを用いて皮膚疾患を治療する方法に関する。
    [0005] 発 明 の 開 示
    [0006] 黄色ブ ドウ球菌は、 かって病原ブ ドウ球菌と呼ばれたよ うに病原性が強く、 様々な抗生物質が開発されている現在 も、 各種化膿性疾患等の原因菌と して臨床的に重要な病原 体のひとつである。 黄色ブ ドウ球菌によって惹起される皮 虜感染症は化膿性疾患が大部分を占め、 この皮虜病変は、 炎症の所謂四大徴候のほか、 落屑、 びらん、 水泡等の皮廣 に特徵的な徵候を含めた混合型をとることが多い。 この多 様な皮庵病変は黄色ブ ドウ球菌の産生する種々の病原因子 によると理解されている。 しかしながら黄色ブ ドウ球菌で は、 同一菌株で 3 0種以上もの菌体外産物を産生したり、 一つの菌体外産物が多彩な生物活性を有し [Wadstrom, T. , Ann, N, Y, Acad. Sci. , 236, 343 (1974) ； Rogolsky, M. , Microbiol. Rev. , 320 (1979)] このこ とが、 菌体外産物 のブドウ球菌感染における役割を明らかにする上で大きな 障害となっている。 従って、 今日まで、 殆んどの菌体外産 物は上記皮虜病変との関係が明らかにされておらず、 勿論 単離、 精製されるにも至っていない。
    [0007] 黄色ブ ドウ球菌 (Staphylococcus aureus ) による皮膚 感染は、 ブ ドウ球菌の皮膚への付着、 侵入及び増殖を伴う 病原性の発揮という経過をとると考えられる。 従って表皮 がその最初の侵襲を受けることになる。 表皮は最外層の角 質層から基底層までの数層の細胞群からなり、 これらの細 胞群は一連の分化過程にある。 何らかの損傷を受けた表皮 に感染した黄色ブ ドウ球菌は、 その場所で上記表皮の組織 構築の乱れや生理機能の低下を起こす何等かの病原因子を 産生し、 その結果と して先に述べた種々の徵候が現れると 考んられ 0
    [0008] 従来、 上記黄色ブ ドウ球菌由来の菌体外産物.と して活性 の明らかにされているものと しては、 僮かにェソテロ トキ シン、 溶血素類 (Hemo s i s Leuko c i di n)、 表皮剥！ ¾毒素 ( E T ： Exfoliative Toxin ) があるに過ぎない [John J. Iandolo, Am, Rev. Microbiol. , 43. 375 ( 1989) ] 。 上記ェンテロ トキシン、 溶血素及び表皮剥脱毒素は、 それ ぞれ嘔吐、 下痢など等を惹起する活性、 赤血球、 顆粒球等 の溶血を惹起する活性及び新生児マウスへの皮内投与によ る表皮剥離を惹起する活性を有する。 本発明者らは、 従来より上記黄色プ ドウ球菌の産生する 菌体外産物の表皮細胞の角質化に対する影響について検討 を行なってきたが、 イスパ （Yu spa)らの方法 [Ce l l, 1|' ' . 245 (1980) ] に従い培養したマウス表皮細胞を利用して、 皮膚病変部より分離した黄色ブドウ球菌の菌体外産物中に、 上記表皮細胞のイ ンビ トロ (in v i tro) での角質化を抑制 する活性因子が存在することを確認し、 該活性因子を単離 することに成功した。 更に、 引続く研究の結果、 該活性因 子のア ミ ノ酸配列及ぴ該因子をコ一 ドする D N A配列を同 定し、 該 D N A配列を含む遺伝子、 これを含むベク タ一、 該べクターを形質転換した微生物の創製及びその形質転換 した微生物を培養する遺伝子工学的手法による上記ポリぺ プチ ドの製造法を確立し、 こ こに本発明を完成するに至つ た。
    [0009] 本発明によれば下記式 （ 1 ) で表わされる 2 1 2個のァ ミ ノ酸配列を有し、 S D S — P A G Eから求めた分子量が 約 2 4 0 0 0ダルト ンであるこ とを特徵とするポリべプチ ド （ C I F ： Comi ii cat ion In i i t in F a c t。 r ) が提供 れ o ) ：
    [0010] I 10 · Ala Asp V a 1 L y s A s n P h e T r As p Leu As , .
    [0011] II 20 G I u A I a T r Ly s T r p Gly As n Ly s L e u 11 e
    [0012] 21 30 ly s G 1 n A I a Ly s Tyr S e r S e r Asp Asp Ly s -
    [0013] 31 40 lie A 1 a Leu Tyr G i u Tyr Thr L y s Asp S e r
    [0014] 41 50
    [0015] S e r L y s l ie A s n G 1 Pro L e u A r g Leu A 1 a
    [0016] 51 60
    [0017] G 1 y Gly Asp lie As n Ly s Leu Asp S e r Thr
    [0018] 61 70
    [0019] Thr Gin Asp Lys Ya I A r g A r g Leu As S e r
    [0020] 71 80 Se r lie Se r L s Se r Thr Thr Pro G 1 u 3 e r
    [0021] 81 90 Va 1 Tyr Va 1 T r Ar Leu Leu As n Leu Asp
    [0022] 91 100
    [0023] Tyr Leu Thr Se r 11 e Va 1 Gly Phe Tli r Asn
    [0024] 101 110
    [0025] Glu Asp Leu Tyr Lys Leu Gin Gin Thr Asn
    [0026] III 120 Asn G i y Gin Tyr As Glu Asn Leu Va 1 Arg 121 130 Ly s Leu Asn Asn Va 1 Met Asn S e r Arg I 1 e 131 140 Tyr Arg Glu Asp Gly T r Ser Ser Thr Gin HI 150
    [0027] Leu Val Ser Gly Ala Ala Yal Gly Gl y Arg
    [0028] 151 160
    [0029] Pro I 1 e G 1 u L e u Arg Leu G 1 u Leu Pro L y s -
    [0030] 161 170 Gly T r Ly s Ala Ala Ty r Leu As n Ser Ly s
    [0031] 171 180 Asp Leu Th r Ala Ty r T r Gly Gin Gin G 1 u 181 190 Val Leu Leu Pro Arg G I y Tli r Gl u Ty r Ala 191 200 Val G 1 Ser V a I G 1 u Leu Ser A s n Asp Ly s 201 210 Ly s Ly s l ie I 1 e l ie Thr Ala lie Val P e 211 212
    [0032] L y s Ly s 本明細書においてべプチ ドにおけるァ ミ ノ酸の表示は、 I U P A Cにより採択されているァ ミ ノ酸命名法における 略号乃至当該分野で慣用されている略号によるア ミ ノ酸残 基の表示法に従う ものと し、 核酸における塩基配列の表示 も同様とする。 本発明のポリペプチ ド （C I F) の有する生理活性、 即 ち表皮細胞角質化抑制活性は後記実施例に詳述する方法に より求められる。 本発明 C I Fは、 上記ア ミ ノ酸配列及び分子量を有する 点において特定される。 本発明 C I Fは、 黄色ブドウ球菌 （Staphylococcus aureus ) に由来する C I F (天然型） だけではな.く 遺伝 子工学的手法によ-つて製造される C I F (合成型） を'も包 含する。
    [0033] 本発明の C I Fは、 そのア ミ ノ酸組成及びァ ミ ノ酸配列 において、 前述の E Tとは明確に区別され、 しかも本, 明 のじ I Fは、 E Tの有する活性、 即ち新生児マウスへの皮 内投与による表皮剥離を惹起する活性を有していない。
    [0034] 本発明の C I Fは、 以下の各種物理的、 化学的性質を有 することによつても特定される。
    [0035] U単一性 ：
    [0036] 本発明の C I F 6 gを 0. 0 5 % ト リ フルォロ酢酸 (T F A) に溶解後、 1 0 %ァセ トニ ト リ ルを含む
    [0037] 0. 0 5 %T F Aで予め平衡化したプロテイ ン （Protein) C 4 (バイダッ ク社製） カラムに添加し、 6 0 %ァセ トニ ト リルまでリニアグラジェン ト溶出を行なった結果、 活性 は単一ピーク と して得られる。
    [0038] また本発明の C I Fは、 還元剤 0— メ ルカ プ ト エタ ノ ー ルの存在下又は非存在下での S D S— P A G Eにより、 い ずれも同一の泳動プロフィ ールを示し、 クーマシーブリ リ アン トブルー （C B B) 染色で単一パン ドと して泳動され、 このことから単一蛋白質であると同定される。 2)クロマ トフ ォーカ シ ングによる等電点 ：
    [0039] P B E 9 4 (フ アルマシアフ ァ イ ンケ ミ カルズ社製） 力 ラムを用いて、 ρ Η 6. 0〜·9. 0の範囲で行なったク ό マ トフ ォーカ シングの結果、 本物質は ρ Η 8. 2付近に溶 出され、 塩基性蛋白質である （p l =約 8. 2 ) と同定さ レる Ο
    [0040] 3) ρ Η安定性及び熱安定性 ：
    [0041] 本発明の C I Fは ρ Η 2〜 1 0の範囲で安定である。 こ の因子はまた、 6 0 °C、 3 0分の熱処理により完全に失活 する。
    [0042] 本発明の C I Fは、 免疫測定法を用いるこ とによつても 確認及び定量することができる。 この様な免疫測定法と し ては、 例えば、 螢光抗体法、 ラ ジオィムノ アツセィ、 酵素 抗体法 （E L I S A) 等が挙げられ、 これらのうち、 操作 の簡便さの点から、 E L I S Aが好ま しい。 E L I S Aは、 具体的には、 マイクロプレー ト中の各ゥエル内にプレー 卜 コーティ ング用の抗 C I F I g Gを固定し、 次いで
    [0043] 0. 1 % B S Aを含有する P B Sで希釈した検体を加え反 応させる。 .その後、 標識抗体を加えて反応させ、 更に
    [0044] 0. 2 5 % o—フヱニレンジァ ミ ン及び 0. 1 5 %過酸化 水素水を加えて反応させ、 次いで 1 N硫酸を加えて、
    [0045] 4 9 2 nmの吸光度を測定する。 これ等の詳細は、 後記実施例に示す通りである。
    [0046] 本発明の C I Fは、 特有の表皮細胞角質化抑制活.性を有 _ する点より、 表皮細胞の生理機能、 細菌による感染の機序 等を解明する上で有用である。 また各種皮膚感染症、 例え ば角質化 （分化一増殖） 異常に関連した疾患である手掌足 底角化症、 魚鱗鲜等の治療に用いる医薬品及び皮唐を柔か く するための化粧料に適用することができる。
    [0047] 以下、 本発明の C I Fの製造法につき詳述する。
    [0048] 本発明の天然型 C I Fは、 例えばブドウ球菌性熱傷様症 候群（Staphylococcal Scalded Skin S y n d r om e： S S S S) 患者 の皮膚から分離されるブドウ球菌の培養により得ることが できる。 上記起源微生物の代表例と しては、 スタ フィ ロコ ッ カス オー レウス E— 1 (Staphylococcus aureus E- 1) 株を例示できる。 該菌株は広島県立病院内科にて SSSSと診 断された 1歲の男児皮膚より分離、 同定された菌株であり、 同病院内科の桑原博士より分与された。 該菌株は微ェ研の 寄託が受付けられないものであり、 本発明者らにより頒布 可能な状態にて保存されている。
    [0049] 上記起源微生物の培養は、 通常のこの種の微生物の培養 と同様にして各種方法に従い行ない得る。 例えば上記菌株 は、 ト リプチケースーソイブロス （Trypticase-soy Broth, Becton Dickinson and Co. , MD， USA)斜面培地にて継代培養 できる。
    [0050] その増殖は、 例えば T Y培地 （イース ト抽出物 1 0
    [0051] / ヽ ト リ プチケース l T gZ^ N a C 5 gZ 、 K 2 H P 0 2. 5 g ) にて、 3 7 °Cで 2 4時間静置 培養した後、 1 0 % C 02 存在下に 3 7 °Cで 2 4時間振盪 培養することにより実施できる。
    [0052] 上記培養により得られる培養液を常法に従い遠心分離、 膜濾過等の操作に付すことによって目的とする C I Fを含 む培養上清を分離収得することができる。
    [0053] かく して得られる培養上清からの C I Fを含む粗標品の 製造は、 従来より知られている各種操作を適宜組合せるこ とにより実施できる。 上記操作と しては、 例えば硫安塩析 等の蛋白沈澱剤を用いる処理、 遠心分離、 透析、 限外濾過 濃縮等を例示できる。
    [0054] また上記粗標品の精製操作も、 公知の各種方法、 例えば ゲル濾過、 液体クロマ トグラフィ 一、 電気泳動、 ァフィ 二 ティ 一ク ロマ ト グラ フィ ー、 ク ロマ ト フ ォ一カ シング、 逆 相高速液体ク ロマ ト グラ フィ ー、 イオン交換カラムク ロマ トグラフィ ー、 これらの組合せ等により行なう こ とができ る。 より詳しく は、 例えば、 T S Kゲル S P— トヨパール 6 5 0 M ( トーソ一社製） 等を用いる陽イオン交換カラ ムク ロマ トグラ フィ ー、 H A— 1 0 0 0 ( トーソ一社製） 等を用いるハイ ドロキシァパタイ トク ロマ トグラフィ ー、 プロテイ ン c4 (バイダヅ ク社製） 等を用いる逆相高速液 体ク ロマ ト グラフィ ー等により精製することができる。 ま た S D S— P A G Eは、 レムリの方法 [Laemrali. U.
    [0055] , Nature, 227, 680 (1970) ] 等に従い実施できる。
    [0056] かく して前記 （ 1 ) のポリペプチ ドを構成タ ンパク とす る本発明の C I F (天然型） を単離収得できる。
    [0057] 本発明の C I Fは、 上記のように、 スタフィ ロコ ッカス オーレウス E— 1株を培養し、 分離精製する方法によって 製造することができるが、 遣伝子工学的手法によっても製 造することができる。
    [0058] 即ち、 本発明 C I F (合成型） は、 C I Fをコ一 ドする 配列を含む遺伝子を利用し、 これを微生物のベクターに組 込んで、 該微生物細胞内で複製、 転写及び翻訳させること によって製造することができる。 この方法は、 特に大量生 産が可能である点から有利であり、 本発明の目的の一つで ある。
    [0059] 上記遣伝子工学的手法による C I Fの製造において用い られる遺伝子は、 C I Fをコー ドする塩基配列を含むこと により特徵付けられる。 本発明は、 かかる新規な C I F遺 伝子をも提供するものである。
    [0060] 本発明者らは、 天然型 C I Fをもとにした遺伝子解析に より C I Fの前駆体のァ ミ ノ酸配列を解明した。 下記式 (2) で示されるア ミ ノ酸配列は、 C I F前駆体のア ミ ノ 酸配列を示すものである。 本発明の C I F遺伝子は、 前述 の式 （1 ) で表される C I Fのア ミ ノ酸配列をコー ドする D N A配列の他に、 C I F前駆体のア ミ ノ酸配列をコー ド する D NA配列を包含する。 式 （2) における塩基配列は このような D NA配列の具体例の一つを、 対応するァ ミ ノ 酸配列と共に示したものであるが、 本発明の C I F遺伝子 はこれに限定されない。 式 （2 ) ：
    [0061] AAAAACAGAATAAATATTTTCTTTTAATAATAAAATATCA 40
    [0062] Ssp I
    [0063] TATAATGAAATTATATATAAATAACAATCAAGAGGAGATTTTT 83
    [0064] ATG AAA AAC AAA TTA CTT TTT AAA ATT TTT 113 Met L y s A s n L y s Leu Leu Phe L y s I 1 e Ph e
    [0065] -35 -26
    [0066] TTG AGT TTA TCT TTA GCA TTA AGC GTT TAT 143 Leu Ser Leu S e r Leu A 1 a Leu S e r V a 1 Ty r
    [0067] -25 -16
    [0068] TCA ATT AAT GAT AAA ATC ATA GAA GTA TCT 173 Ser lie A s n Asp L y s l ie I 1 e G 1 u V a 1 Ser
    [0069] -15 -6
    [0070] -<:
    [0071] C
    [0072] CO J
    [0073] 1-H
    [0074] e— <
    [0075] ：
    [0076] CD -<
    [0077] D CD
    [0078] vv 2
    [0079] AAT ACT TCT TTA GCA GCT GAT GTT AAA AAT 203 A s n Thr 8 e r Leu Ala A 1 A s p V a 1 L y s A s n
    [0080] -5 -1 1- 5
    [0081] TTC ACT GAT TTA GAT GAG GCA ACT AAA TGG 233 Ph e Thr As Leu Asp G 1 u Ala Thr Ly s Trp
    [0082] 6 15
    [0083] GGG AAT AAA CTT ATA AAA CAA GCT AAG TAT 263 G 1 y A s n Ly s L ε u I 1 e Ly s Gin A i a Ly s T y r
    [0084] 16 25
    [0085] AGT TCG GAT GAT AAA ATA GCT CTA TAC GAA 293 S e r S e r Asp A s p L y s l ie Ala Leu T y r G 1 u
    [0086] 26 35
    [0087] TAT ACA AAA GAT AGT TCT AAG ATA AAT GGT 323 Ty r Thr Ly s As S e r S e r Ly s lie A s n G 1
    [0088] 36 45
    [0089] CCA TTA AGA CTC GCA GGT GGA GAT ATT AAT 353 Pro L e u A r g L e u Ala G 1 y G 1 Asp l ie A s n
    [0090] 46 55
    [0091] AAG CTA GAT TCA ACA ACT CAA GAC AAA GTA 383 Ly s Leu As p S e r Thr Thr G 1 n As Ly s Va 1
    [0092] 56 65 TAC TCT AGT ACA CAA TTA GTT AGT- GGA GCA 623 Ty r Se r Se r Th r Gin Leu Va 1 Se r G I A 1 a
    [0093] 136 145
    [0094] GCT GTA GGT GGT AGA CCT ATT GAA TTA AGG 653 Ala Va 1 Gly G 1 y Arg Pro lie G i u Leu Arg
    [0095] 146 155
    [0096] TTA GAA TTA CCA AAA GGG ACT AAA GCT GCG 683 Leu G 1 u Leu Pro L y s Gly Th r Ly s Ala A I a
    [0097] 156 165
    [0098] TAT CTT AAT TCT AAA GAT TTA ACT GCT TAC 713 Ty r Leu A s n S e r Ly s Asp L e u Th r Ala Tyr
    [0099] 166 175
    [0100] TAT GGT CAA CAA GAA GTT TTA TTA CCT AGA 43 Tyr G i y 61 n Gin G 1 u Va I Leu Leu Pro Arg
    [0101] 176 185
    [0102] GGC ACA GAA TAC GCT GTT GGA AGT GTA GAA 773 Gly Thr Glu Tyr A! a Va 1 Gly Ser Va I Glu
    [0103] 186 195
    [0104] TTG TCA AAT GAT AAA AA6 AAA ATC ATA ATA 803 L e u Ser A s n Asp Ly s Ly s L y s I 1 e lie lie
    [0105] 196 200 ACA GCT ATT GTT TTT AAA AAA TAG AAA TAT 833 T r Ala I 1 e Ya I Pli e Ly s Ly s ***
    [0106] 206 212
    [0107] AAACAAAGTAATAACAAGGATTAATAAATTAAAAATTTT 873. . AATTAATATTTTCTATAACTAAAAGAA 900 Ssp I 本発明の C I F遣伝子は、 例えば以下に示すように C I Fを産生しているブ ドウ球菌株から製造できるほかに、'一 般に知られている種々の方法で製造できる。 例えば本明細 書に開示した C I F及びその遺伝情報に基いて、 ホスフ ァ イ ト ト リエステル法 [ Nature, 310, 105 ( 1984 ) ] 等の常 法に従って核酸の化学合成を行う方法、 或いは上記各種方 法を併用する方法等を実施することにより製造することが できる。 以下に、 本発明の C I F遗伝子の製造法のうち、 C I F を産生しているブ ドウ球菌株から製造する方法につき、 よ り詳細に説明する。 該遺伝子は、 C I Fを産生しているブドウ球菌株から得 るこ とができ、 上記微生物の代表例と しては、 スタフイ ロ コ ッ カス オー レウス E— 1 (Sta hylococcus aureus E 一 1 ) 株を例示できる。 上記微生物の染色体 D N Aの抽出 は、 通常の各種方法に従って行う-こ とができる。 例えば、 菌体をリ ゾスタ フィ ン （Lysostaphin ) によ り溶菌し、 続 いて S D S処理、 フエノールノク ロロホルム処理およびェ 夕ノール沈殿を行う こ とにより、 D N Aを回収できる。■ . かく して得られる D N Aからの C I F遣伝子のスク リ ー ニングは、 従来より知られている各種操作を組合わせるこ とにより実施できる。 例えば D N Aを市販の各種制限醇素 で切断した後、 電気泳動にて D N Aバン ドを分離し、 サザ ンブロッティ ングにより C I F遺伝子をスク リ ーニングで きる。 サザンプロッティ ングは、 電気泳動にて D N Aフラ グメ ン トを分離した後二 ト ロセルロースメ ンブレ ンフ ィ ル ターに転写し、 これを標識したプローブと反応させると、 プローブが目的の D N A配列に選択的に結合するという性 質を利用して、 目的の遺伝子をスク リ ーニングするもので ある。 こ こでプローブとは、 目的の D N A配列に対して相 補的な配列を有する核酸配列であり、 化学合成した D N A 配列を用いるのが一般的であり、 また有利である。 上記プ ローブの D N A配列は、 目的とする C I Fのア ミ ノ酸配列 に基づいて設定することができる。 かく して得られる D N A断片中に本発明遺伝子が含まれている。
    [0108] 上記において得られた C I F遺伝子は、 常法に従って各 種プラス ミ ドにクローニングするこ とができる。 例えば E c 0 R Iで切断して精製した C I F遺伝子を含む断片を、 同様に E c o R I にて切断した p B R 3 2 8 [X. Soberon, L. Cova r r ub i a s and F. Bo 1 i ar, Gene^, 287 ( 1980 ) ] の切断 部位へ掙入すれば良い。 これにより所望の組換えべクタ一 を得ることができる。 また、 得られる組換えベクターの宿 主への導入及びこれによる組換えベクターの増幅と個別化 は、 一般に用いられている各種の方法、 例えば主と して対 数増殖期にある細胞を集め、 C a C 2 処理或いはプロ 卜 - プラス ト化処理により 自然に D N Aを取り込みやすい状態 と し、 これにべクタ一を取り込ませる方法等により行い得 o
    [0109] なお、 上記において採用される各種の操作、 例えば一部 D N Aの化学合成、 D N A鎖の切断、 削除、 付加ないし結 合を目的とする酵素処理、 D N Aの単離、 精製、 複製、 選 択等はいずれも常法に従う ことができる。 より具体的には、 上記 D N Aの単離精製は、 ァガロースゲル電気泳動等に従 う こ とができる。
    [0110] また、 上記で得られる本発明遣伝子の D N A配列の決定 は、 サンガー法 [Yan i s ch-Pe r ron e t a 1. , Gene, 33, 103 (1985 )] 、 マキサム一ギルバー ト法 [A. M, Maxam and W.
    [0111] Gi Ibert, Methods in Enzymology, 65, 499 ( 1980 )] 等により 行い得る。 さ らに上記 D N A配列の決定は、 市販のシーケ ンスキッ ト等を用いるこ とによつても容易に行い得る。
    [0112] 上記により、 各種の文献 [例えば j, E. Darnel 1 et a I. , "Molecular Cel l Biology" ， Scientif ic American Books (1986 ) ] の記載を参考にして、 目的の C I F遣伝 子を含む D N A配列及びア ミ ノ酸配列を決定できる。
    [0113] かく して決定された目的の C I F遣伝子を含む D N A配 列及び対応するア ミ ノ酸配列の一例は、 式 （ 2 ) に示され る通りである。 これは正確には C I F前駆体の D N A配列 及びア ミ ノ酸配列である。 上記 C I F前駆体ァ ミ ノ酸配列 中のシグナルべプチ ド部分のァ ミ ノ酸配列は、 例えばフォ ン ノヽイネ （Von H e ί j n e ) の方法 [Nucl. Acids Res, , 14, 4683 ( 1986)] に従い決定できる。 それによれば、 この D N A記列は、 式 （ 2 ) に示されるように、 C I Fのア ミ ノ酸 配列の N端の 3 5アミ ノ酸残基 （一 3 5〜― 1 ) に相当す るシグナルぺプチ ドの付加された C I F前駆体をコ一 ドす るものであり、 C I F前駆体から該シグナルペプチ ド部分 が除去されて生成する成熟 C I Fは、 式 （ 1 ) のア ミ ノ酸 配列からなる。 このことは、 C I Fが上記前駆体と してま ず生合成され、 その後シグナルペプチ ド部分が除去される 分泌性の蛋白質であることを明らかにしている。
    [0114] 本発明の C I F遺伝子を利用し、 遺伝子組換え技術に従 う ことにより、 C I Fを大量に収得することができる。 上 記技術においては該遺伝子が宿主細胞中で発現でき得る.よ うな組換え D N Aを作成する。 該組換え D NAの作成は、 当該技術分野における通常の方法に従うことができ、 本明 細書に開示の C I Fの遺伝，情報に基いて容易に実施できる。 具体的操作について、 以下 より具体的に詳述する。
    [0115] 宿主細胞と しては、 真核生物及び原核生物のいずれも用 いることができる。 該真核生物の細胞には、 脊椎動物、 酵 母等の細胞が含まれ、 脊椎動物と しては、 例えば C o s細 胞 [Y, Gluzi n, Cel 1, 175 ( 1981 ) ] やチャイニーズ ハムスター卵巣細胞のジヒ ドロ葉酸レダクターゼ欠損株
    [0116] [G. Ur 1 aub and L. A. Ch a s i n, P r u c. N a t 1 , A c a d, S c i . , D S A, - Π, 4216 (1980) ] 等がよく用いられているが、 これらに限 定されるわけではない。 脊椎動物細胞の発現ベクターと し ては、 通常発現しょう とする遺伝子の上流に位置するプロ モーター、 R N Aのスプライス部位、 ポ リ アデニル化部位 及び転写終了配列等を保有するものを使用でき、 これは更 に必要により複製起点を保有していてもよい。 該発現べク ターの例と しては、 S V 4 0の初期プロモーターを保有す る p S V 2 dhf r [S. Subramani, R. Mulligan and P. Berg , Mol. Cell Biol. 854 (1981)] 等を例示できるが、 これ に限定されない。
    [0117] また真核微生物と しては酵母が一般によく用いられてお り、 その中でもサッカロ ミ セス属酵母が有利に利用できる。 該酵母等の真核微生物の発現ベクターと しては、 例えば酸 性ホスフ ァターゼ遣伝子に対するプロモータ一をもつ p A M 8 2 [A. Miyanohara e t a 1. , Proc. Na 11. Acad. Sc i, , USA, 80- 1 ( 1983) ] 等を好ま しく利用できる。 '
    [0118] 原核生物の宿主としては、 大腸菌や枯草菌が一般によ く 用いられている。 本発明では例えば該宿主菌中で複製可能 なプラス ミ ドベクターを用い、 このべクタ一中に C I Fの 遺伝子が発現できるように C I F遺伝子の上流にプロモ一 タ一及び S D (シャイ ン · アン ド · ダルガーノ） 配列、 更 に I F遣伝子の下流に転写終了配列等を付与した発現プ ラス ミ ドが使用できる。
    [0119] 例えば、 宿主菌と しての大腸菌と しては、 ェシエ リ ヒア コ リ （E. eoli) K 1 2株等がよく用いられ、 この宿主菌に 用いられるベクターと しては、 一般に P B R 3 2 2がよく 用いられるが、 これに限定されず、 公知の各種の菌株及び ベクターがいずれも利用できる。 プロモーターと しては、 例えばト リ ブトフ ァ ンプロモーター、 P L プロモーター、 l a cプロモーター、 l p pプロモータ一等を使用するこ とができ、 いずれの場合にも C I F遺伝子を発現させるこ とができる発現プラス ミ ドを作ることができる。 該発現プ ラス ミ ドで、 C a C 2 処理により D N Aを取込みやすい 状態と した大腸菌を形質転換させて得られた形質転換株を 常法に従い培養することにより C I Fを収得できる。 更に他の例において、 宿主菌と しての枯草菌と しては、 バチルス ズブチリ ス （B, subutilis)Marbur 168 株等が よく 用いられ、 この宿主菌に用いられるベクタ一と しては、 —般に p U B 1 1 0又はこれに由来するシャ トルべクタ一 がよく 用いられるが、 これに限定されず、 公知の各種の菌 株及びベクターがいずれも利用できる。 プロモータ一と'し ては、 α—ア ミ ラーゼプロモータ一、 中性プロテアーゼプ 口モーター、 S Ρ 02プロモーター等を使用することがで き、 いずれの場合にも C I F遺伝子を発現させることがで きる発現プラスミ ドを作ることができる。 プロ トプラス ト 化処理された枯草菌をこの発現プラス ミ ドで形質転換させ、 目的の形質転換株を常法に従い培養することにより C I F を収得できる。
    [0120] 遺伝子組換技術により天然型 C I Fと同一の構造を有す る合成型 C I Fを効率よく収得するためには、 C I Fをシ グナルペプチ ドとの融合蛋白質と して発現させ、 菌体外又 はペリ ブラズム部に移動させた後、 成熟蛋白質と して C I Fを得る。 或いは、 発現ベクター中に C I F遺伝子を複数 個導入し、 同時に発現させる等の各種の方法がある。 融合 蛋白質と して発現させる場合のシグナルペプチ ドと しては、 アルカ リ フォスファターゼ、 アンピシリナーゼ、 α—ア ミ ラーゼ、 ^一グルカナーゼ、 ニュー トラルプロテアーゼ、 スフィ ンゴミエリナ一ゼ等の各種の酵素のシグナルべプチ ドを用いることができる。
    [0121] 上記により 目的の組換え体の細胞内又は細胞外に生産さ れる C I Fは、 常法に従い分離され、 C I Fの物理的、 化 学的性質等を利用した各種の処理操作に従い単離精製する こ とができる。 該処理操作の具体例は、 前記した通りであ かく して遺伝子工学的手法により、 本発明の C I F (合 成型） を製造できる。
    [0122] 本発明の C I Fは、 表皮細胞角質化抑制活性を有してい る。 従って、 C I Fは、 手掌足底角化症、 魚鱗鲜等の角質 化異常に関連する皮虜疾患症状のための予防用又は治療用 医薬品として有効に利用でき、 更に美容上皮廣を柔かく す るための化粧料と しても利用することができる。
    [0123] 本発明の C I Fは、 软膏、 チンクチャ一、 ク リ ーム、 溶 液、 ローショ ン、 懸濁液等の形態で用いることができる。 この様な形態の C I F含有医薬品又は化粧料には、 油分、 水、 界面活性剤、 保湿剤、 アルコール、 増粘剤、 香料、 酸 化防止剤、 キレー ド化剤、 色素、 防腐剤等の皮膚科領域に おいて通常使用することができる添加剤を適宜配合するこ とができる。
    [0124] 例えば、 ク リ ームの形態とする場合には、 界面活性剤、 脂肪質、 防腐剤、 酸化防止剤等を添加する。 界面活性剤と しては、 ポリオキシェチル化脂肪族長鎮アルコール、 その グリ セライ ド、 ソルビ ト一ル誘導体 （スパン、 ツイ 一ン等） 、 それらの混合物などの非イオン性界面活性剤等を挙げる こ とができ る。 脂肪質と しては、 飽和半固体又は液体炭化 水素、 飽和又は不飽和脂肪酸及びそれらの ト リ グリ セライ ― ド、 長鎖脂肪族アルコール、 植物または動物ワ ッ ク ス、 こ れらの混合物などを挙げるこ とができる。 具体的には、 ヮ セ リ ン、 カプリ ル酸、 その ト リ グリ セライ ド、 力プロ ン酸、 その 卜 リ グリ セライ ド、 セチルアルコール、 ステア リ ルァ ルコール、 ラ ノ リ ン、 パラフィ ン等を挙げるこ とができ る。 防腐剤と しては、 フ ヱノ ール類、 ベンジルアルコール、 7 — ヒ ドロキシ安息香酸及びその塩、 モノ チォグリ セロール、 チメ ロザ一ル、 ベンズエ トニゥムク ロライ ド、 ク ロロブタ ノ ール、 デヒ ドロ酢酸ナ ト リ ウム、 イ ミ ダゾリ ジニル尿素 及びその誘導体、 ベンジルアルキルア ンモニゥムク ロライ ド、 p —ク ロ 口フエノ ール、 p — t —ブチルフエノ ール、 セ リ ウム mナイ ト レー ト、 セチルアルキルア ンモニゥムク 口ライ ド、 セチルジェチルメ チルア ンモニゥムブロマイ ド、 ク ロロチモール、 ク レゾール類、 安息香酸ナ ト リ ウム等が 挙げられる。 酸化防止剤と しては、 ァスコルビン酸、 ビタ ミ ン E、 ァスコルビルパルミ テー ト、 プチルヒ ドロキシァ ニゾ一ル等を挙げるこ とができる。 更に、 アルブミ ン、 ァ ミ ノ酸、 無機塩、 イオン性界面活性剤などの蛋白安定化剤 を添加することができる。
    [0125] C I Fの投与量は、 使用形態、 年令、 体重等により変化 する。 非経口的には通常成人の一日当り有効成分 （ポリべ プチ ド） と して 1 g〜 l m gを 1回又は数回に分け,！：投 与する。
    [0126] 図面の簡単な説明
    [0127] 第 1図は、 実施例 1に従う C I Fの精製工程 （3)
    [0128] (iii)における逆相高速液体ク ロマ グラフィ 一の結果を 示す。
    [0129] 第 2図は、 実施例 1の （5) に従う C I Fの最終精製標 品の逆相高速液体ク口マ トグラフィ —の結果を示す。
    [0130] 第 3図は、 実施例 3の （1) に従う α—ア ミ ラーゼプロ モーターを含むプラス ミ ド ρ ΗΜΟ 4の構築及び実施例 3 の （2) に従う C I F発現ベクター p E D Κ 7の構築の概 要を示す。 図中、 雇 は C I F前駆体遣伝子を、 争は — ア ミ ラーゼプロモーターを、 →はアンピシリ ン耐性遺伝子 (A p r ) 又はカナマイ シン耐性遺伝子 （Kmr ) を、 © 及び (Dはそれぞれ大腸菌及び枯草菌の複製開始領域を示す。
    [0131] 実 施 例
    [0132] 以下、 本発明を更に詳しく説明するため、 実施例を挙げ る。 尚、 C I Fの生理活性は、 次の方法により測定評価し た。 .， ，
    [0133] [表皮細胞角質化抑制活性の測定]
    [0134] ( 1 ) 表皮細胞培養用培地の調製
    [0135] C a 2 +を含まないイーグル M E M (Eagle' s Minimum - Essential Medium (J ok 1 i k-mod i { i ed) ) にペニシ リ ン G 7 5 U/"m 1 及びス ト レプ トマイ シン （Grand Island
    [0136] Biological Co. , NY, USA) 5 0 z g / m 1 を加え、 更にキ レ ッ ク ス一 1 0 0樹脂 （Chelex-100 Resin, Bio Rad Lab. . Richmond, CA, USA)で処理した牛胎児血清 （F C S ) を 1 0 %となるように加え、 0. 3 M C a C ^ 2 溶液で C a濃 度を 0. 0 5 mMに調製して、 低濃度 C a培地 （ L C M) を得た。
    [0137] また上記と同様にして C a濃度を 1. O mMに調製した 高濃度 C a培地 （H C M) を調製した。 尚、 上記各培地の C a濃度は原子吸光計 （日立、 2 0 7型） を用いて測定し o
    [0138] ( 2 ) 表皮細胞の培養
    [0139] I C R系 C D— 1新生マウスよ り背部皮虜を採取し、 0. 2 5 % ト リ プシン （阪大微研） にて 4 、 2 4時間処 理した後、 実体顕微鏡 （ォリ ンパス Κ, X T r型） 下で表 皮のみを採取し、 更にそれを 0. 2 5 % ト リプシ ンで 3 7 eC、 1時間処理して表皮細胞を単離した。 ト リパンブル一 を用いた色素排除試験 [Schrek, R. , Arch. Pathol. , 37, 319 , (1944)] により生細胞数を算出し、 3 5 プラスチッ ク シ ャ一 レ （Becton Dickinson and Co. , USA) に 1 x 1 06 細 胞 ウエルとなるように、 またセルゥエル （Cell Wells, 24 -we 11 f 1 at bottom , Corning, NY, USA)に約 3 x 1 05 細 胞 /ゥヱルとなるようにそれぞれ接種し、 L C Mにて 7 日 間 5 % C 02 存在下で培養して実験に供した。
    [0140] (3 ) 表皮細胞の形態的分化の観察
    [0141] L CMで培養した表皮細胞を H CMに移し、 4 8時間経 時的に倒立顕微鏡 （ニコン MTD , 日本光学社製） 下でその 形態変化を観察した。
    [0142] (4) 表皮細胞の角質化の定量
    [0143] 表皮細胞の角質化の定量は、 ピールらの方法 · [Peehl, D. M. and Ham, R, G. , Growth a n d dif ferentiation of human keratinocytes without a feeder or conditioned
    [0144] medium. In Vitro, H, 516 (1980) 3 に従い、 以下の通り実 施した。
    [0145] 即ち、 L CMで培養した表皮細胞を H CMに移し 4 8時 間培養後、 0. 2 5 % ト リプシン + 0. 0 2 % E D T A処 理を行ない、 細胞浮遊液を得、 その一部を採取し、 血球計 算板を用いて顕微鏡 （ニコ ン 0PT1PH0T, 日本光学社製） で 細胞数を算定した後、 2 % S D S— 2 0 mMジチオス レィ トールで 9 0 °C、 1 0分間処理して不溶性のエンベロープ (Cornif ied Envelope) を抽出した。 得られた不溶性ェン ベロ一プ数を血球計算板により算定した後、 その全細胞中 に占める割合を算出し、 これを角質化細胞％
    [0146] Corni f i ed Ce 11 s)と した。
    [0147] ( 5 ) 表皮細胞角質化抑制活性の検出と定量
    [0148] 3 5 プラスチッ ク シャーレを用いて L CMで培養した 表皮細胞を H CMに移す際に、 検定標品を添加し、 上記 ( 3 ) 及び （4) の方法を行なって角質化抑制活性の検出 と定量を行なった。 また簡易検定法と してセルゥュルを用 いて培養した表皮細胞を H CMに移す際に、 リ ン酸塩緩衝 生理食塩水 （P B S) により倍々希釈した検定標品を添加 して上記 （ 3 ) の方法を行なって角質化抑制活性の検出を 行なった。
    [0149] 実施例 1
    [0150] ( 1 ) 菌の培養と培養上清の調製
    [0151] ト リ プチ力一ゼーソイ ブロス （Try pt i case-soy Broth) 斜面培地 （Becton Dickinson and Co. , MD, USA) にて継代 培養したスタ フ イ ロ コ ッ カス オー レウス E— 1 (Staphy lococcus aureus E- 1)の 1白金耳を、 T Y培地 （イ ース ト 抽出物 10 gZ l、 ト リ プチ力一ゼ 17 gZ l、 a C ^ 5 gZ l、 K 2 H P 04 2. 5 g / 1 ) 30m l に接種し、 3 7 °C下 2 4時間静置培養後、 同培地 3 Ά に移し、 1 0 % C 02 存在下で 3 7 °Cで 2 4時間振盪培養した。 その培養 液を 5 0 0 0 x g、 2 0分間遠心分離し、 得られた上清を ポアサイズ 0. 2 2 /z mのフィ ルター （ミ リ ポア社
    [0152] (Mil lipore Co. , Mass, USA)) で炉過し、 培養上清標品と.し た。
    [0153] ( 2 ) 硫安塩析及び濃縮による粗標品の調製
    [0154] 上記 （1) で得た培養上清標品に、 75%飽和となるよ うに固形硫安を加え、 4でで 2 4時間放置後、 1 0 0 0 0 X gで 3 0分間遠心分離して沈澱を得た。 これを 5 0 mM リ ン酸塩緩衝液 （p H 7. 0 ) に対して透析し、 約 5 0倍 に濃縮して、 濃縮培養液 （C C F) を調製した。
    [0155] 上記粗標品について表皮細胞角質化抑制活性を検討した 結果、 L C Mで培養した表皮細胞は上皮細胞に特有の美し い敷石状の配列を示し、 個々の細胞は小さ く、 比較的均一 で、 細胞間には明瞭な細胞間隙が認められた。 この細胞を H CMに移して分化を誘導すると、 細胞は著しい形態的変 化を起こした。 即ち、 細胞は徐々に膨化し、 細胞間に接着 斑 （desmoso e ) が形成された。 細胞はやがて垂直層化
    [0156] (vertical stratif ication ) を起こ し、 分化誘導後 2 4 時間頃より角質膜を有する細胞 （角質化細胞 ； CGfiiiiied Ce l l) が増加し始めた。 分化誘導 4 8時間後には、 個々の 細胞は著しく その大きさを増し、 角質化細胞が数多く 認め られた。
    [0157] H C Mに移して分化誘導する際に硫安塩析画分より得た 粗標品を適当量 （ 2. 5 — 2 0 g蛋白/ m 1 ) 添加して おく と、 C a によって誘導される形態的分化は完全に抑制 ' された。 即ち、 それぞれの細胞はコ ン ト ロールに比しやや 大き く なつているものの、 明らかな細胞間隙が認められた。 また角質化細胞の出現は殆んど認められなかった。
    [0158] この細胞を粗標品を除いた H C Mで更に培養を続けると、 それぞれの細胞は粗標品非添加の場合と同様に分化した。 また粗標品添加又は非添加の H C Mで 4 8時間培養した細 胞を非添加の L C Mに移すと、 非添加細胞はもはや、 もと の敷石状の配列に戻ることができず、 増殖能は回復しなか つた。 しかしながら添加細胞は L C Mに移して数分後から 形態変化を始め、 2時間後には元の敷石伏の配列に戻り、 2 4時間後には細胞の分裂像を認めた。
    [0159] 以上のこ とから、 粗標品による角質化抑制は可逆的であ ることが示された。
    [0160] 次に角質化抑制活性を定量化するために前記 [表皮細胞 角質化抑制活性の測定] の （ 4 ) に従って角質化細胞％
    [0161] (% corni { i ed C e 1 i s)を算出したと ころ、 粗標品添加細胞 は非添加細胞に比べて角質化細胞％は著しく 低く 、 L C M で培養した表皮細胞のそれと同程度であつた。
    [0162] ( 3 ) ク ロマ ト グラ フィ ーによる精製
    [0163] 上記 （ 1 ) で得た培養上清標品に、 7 5 %飽和となるよ うに固形硫安を加え、 4 °Cで 2 4時間放置後、 1 0 0 0 0 X gで 3 0分間遠心分離して沈澱を得た。 これを 5 0 m:M- リ ン酸塩緩衝液 （p H 7. 0 ) に対して透析して得られた 濃縮培養液 （C C F ) について、 以下の各ク ロマ トグラフ ィ 一操作を実施した。
    [0164] なお、 各操作における蛋白質の定量は、 牛血清アルブミ ン （B S A) を標準と し、 染色固定法 〔dye f ixation method, Bio Ra d Lab, , Bradford, M, M. , Anal. Biochem. , U, 249 ( 1976)] により行なつた。
    [0165] (ί) 前記した濃縮培養液 （C C F ) を出発材料と して用い、 これを予め 5 0 mMリ ン酸塩緩衝液 （ ρ Η 5. 0 ) に対し て透析後、 同緩衝液で平衡化した T S Kゲル S P— ト ヨパ ール 6 5 0 M (トーソ一社製、 流速 4 m 1 Z分） カラムに 添加し、 カラム容積の数倍量の同緩衝液で非吸着画分を洗 い流した所、 その活性はカラムに吸着し、 素通り画分には 活性が認められなかった。 次いで、 5 0 mMリ ン酸塩緩衝 液 （p H 5. 0 ) から 5 0 mMリ ン酸塩緩衝液 + 0. 5 M N a C ^ ( p H 5. 0 ) までのリ ニアーグラジェン ト溶 出を行なって、 2 2 0— 3 0 0 mM N a C ^付近に溶出 される活性画分を集めた。 ノ 、 .
    [0166] (i i)上記活性画分を、 5 0 m'Mリ ン酸塩緩衝液 （ p H
    [0167] 6. 9 ) に対して透析し、 同緩衝液で平衡化した H A— 1 0 0 0 ( トーソ一社製、 流速 1 m 1 分） 力.ラムに 加. した。 カラム容積の数倍量の同緩衝液で非吸着画分を洗い 流し、 次いで 0. 5 Mリ ン酸塩緩衝液 （ p H 6. 9 ) まで の リニア一グラジェン ト溶出を行ない、 0. 3 5 M付近に 溶出される活性画分を集めた。 - (iii) 上記活性画分を ト リ フルォロ酢酸 （T F A) を用い p H 5. 0に調整し、 1 0 %ァセ トニ ト リ ルを含む
    [0168] 0. 0 5 % T F A溶液で予め平衡化したプロテイ ン C 4 (バイダッ ク社製、 流速 1 m 1 Z分） カラムに添加し、 次 いで 6 0 %ァセ トニ 卜 リルまでリニアグラジェン ト溶出を 行った。 その結果、 活性を単一ピーク と して得た。
    [0169] 上記逆相高速ク口マ トグラフィ 一の結果を第 1図に示す。 図において横軸はフラク ショ ン N 0.を、 縦軸は 2 8 0 nmで の吸光度及びァセ トニ 卜 リルの濃度 （ ） を、 I 1 は活 性画分を示す。
    [0170] 上記各精製ステップの要約を示せば下記第 1表
    [0171] の通りである。 第 1
    [0172]
    [0173] 尚、 表中活性単位 （U) は、 5 X 1 05 個の細胞を 0. 3 m l の H C M中に移し、 希釈したサンプルを添加し た時、 4 8時間以内の角質膜形成抑制に必要な最小活性量 を 1ュニッ ト と して表した。 この時、 同様にして形態分化 の抑制も確認した。
    [0174] ( 4 ) S D S - P A G E電気泳動
    [0175] ドデシル硫酸ナ ト リ ウム （ S D S ) —ポ リ ア.ク リ ルア ミ ドゲル （ P A G E ) は、 レム リ の方法 [Laemml i, U. ， Nature, 227, 680 (1970) ] を一部改変して実施した。
    [0176] ポリアク リルア ミ ドゲルは、 濃縮用に 3 %のものを、 分 離用に 1 0 %のものをそれぞれ用いた。 また染色はクマ一 シーブリ リ アン トブルー （ C B B ) を用いて行なった。 上記精製ステッ プの最終段階で得られた活性画分 （本発 明 C I F ) にっき行なった上記 S D S — P A G Eの結果、 該 C I Fは分子量マーカーであるカルボニックアンヒ ドラ ―ゼ （分子量 3 1 k) と ソィ ビーン ト リ プシ ン イ ン ヒ ビター （分子量 2 1. 5 k ) の間に泳動され、 このことカヽ らその分子量は約 2 4 0 0 0ダルト ンと認められた。
    [0177] また上記 C I Fを還元剤 一メ ルカプトエタノール存在 下及び非存在下にて、 上記 S D S - P A G Eを繰返した結 果、 その泳動プロフィ ルは共に同じであり、 C B B染色で 単一のバン ドと して泳動された。 このことから本発明 C I Fはサブュニッ 卜構造をとらない単一蛋白質であると同定 された。
    [0178] ( 5 ) C I Fの単一性
    [0179] 上記精製ステップ （ 3 ) (Mi) で得た最終標品にっき、 その 6 gを 1 0 %ァセ トニ ト リ ルを含む 0. 0 5 %T F A溶液で予め平衡化したプロテイ ン C4 カラムに添加した。 次いで 6 0 %ァセ トニ ト リ ルまでリニアグラ ジェン ト溶出 を行なった結果、 C I F活性は単一ピーク と して溶出され た。
    [0180] 上記逆相高速液体ク ロマ トグラフィ 一の結果を第 1図と 同様にして第 2図に示す。
    [0181] ( 6 ) ク ロマ ト フ ォーカ シング
    [0182] 上記精製ステップ （ 3 ) (i) で得た部分精製標品につい て、 2 5 mMエタノ ールァミ ン一酢酸 （ p H 9. 5 ) で平 衡化した P B E 9 4 (フ アルマシアフ ァイ ンケ ミ カルズ社 製） カラムを用い、 ポリバッ フ ァー 9 6—酢酸 （p H
    [0183] 6. 0 ) で溶出させて、 p H 9. 0— 6. 0の範囲でク ロ マ トフ ォーカ シングを行なった結果、 上記活性は P ί
    [0184] 8. 2付近に溶出された。
    [0185] ( 7) C I Fの表皮細胞角質化抑制活性
    [0186] 精製ステッ プの最終段階 （ 3) (iii) で得られた C I F について、 表皮細胞の形態分化の抑制及び Cornif ied Cel l の出現抑制に要する最小量を、 前記活性測定法に従い求め た。
    [0187] その結果、 上記最小量は約 0. 0 1 8 8蛋白ノ111 1 で あつァこ o
    [0188] また、 上記 C I Fの活性は、 前記粗標品と同様に可逆的 でめつた o
    [0189] (8 ) p H安定性
    [0190] 精製ステッ プ （ 3 ) (i) で得た部分精製標品を、 P H 2. 0 - 1 1. 0の 5 0 mM緩衝液 [クェン酸— リ ン酸塩緩衝 液 ： p H 2— 6、 リ ン酸塩緩衝液 ： p H 7. 0、 グリ シン - N a 0 H緩衝液 ： p H 8— 1 1 ] で、 4 °C、 2 4時間透 折した後、 P B Sで 4 °C、 2時間透析したものを用いて、 残存活性の検討を行なった。
    [0191] その結果、 C I F活性は p H 2— 1 0の範囲で安定であ つた。 ( 9 ) 熱安定性
    [0192] 最終精製標品について、 DRY THERMOUNIT TAH-1 (大洋） で、 加熱処理 （ 4 0— 1 0 0 °C、 3 0分） 後、 氷浴中で急 冷したものを用いて、 その活性の検定を行なった。
    [0193] その結果、 （ 1 の活性は 6 0で、 3 0分間の熱処理に より完全に失活した。
    [0194] ( 1 0 ) C I Fのァ ミ ノ酸組成
    [0195] 精製 C I F溶液約 2 0 g相当量を硬質ガラスサンプル 管 （日電理化硝子社製、 6 X 4 0 mm) にとり、 加水分解用 反応バイアル （ピアース社製） に入れ、 真空乾固後、 6 N 一塩酸 （含 1 %フ ヱノール） 2 0 0 / ^を該反応バイアル に入れ、 減圧密封し、 1 3 0 °Cで 4時間加水分解を行なつ た。
    [0196] 反応後、 サンプル管に N a— S TM溶液 （べッ クマン社製）
    [0197] 2 0 0 1 を加え、 ア ミ ノ酸分析用サンプル管に移し、 そ の を 6 3 0 0 E型ア ミ ノ酸分析計 （ベッ クマ ン社 製） に自動注入してア ミ ノ酸組成の分析を行なった。 尚、 検出法と してはニンヒ ドリ ン法を用いた。 この方法では ト リブ ト フ ア ンは検出されない。
    [0198] 分離同定された各ア ミ ノ酸を、 標準ア ミ ノ酸 （ 1ナノモ ル） で作成した検量線により定量し、 分子量が 2 4 0 0 0 位になるように、 フヱニルァラニンを 3個含むものと して、 その組成比を算出した。
    [0199] 得られた結果を下記第 2表に示す。 一 第 2 表 成ァ ミ ノ ァ ミ ノ 酸 組 成 比 分析値 • ϋWfc
    [0200] 値
    [0201] 7 スノヽ フ ヤ ノ酸 2 9 . 9 ο υ ス レ才ニン 1 4 . 8 1 5 t
    [0202] セ リ ン 1 5 . 1 1 8 ヌノレ夕 ノ酸 1 9 . 3 丄 9 プロ リ ン 4 . 9 5 ク リ ン ノ 1 3 . 7 - 丄 4 フ ー ノ 1 1 . 9 1 ンスチ ノ U u
    [0203] ， ， 11
    [0204] ノヽ V 1 1 . 6 丄 d メ チォニン 0 . 9 1 イ ソ ロイ シン 9 . 4 1 2 ロイ シン 2 4 . 0 2 4 チロ シン 1 3 . 6 1 4 フエ二ルァラニン 3 . 0 3 リ ジン 2 0 . 9 2 1 ヒスチジン 0 0 ト リ ブ ト フ ァ ン N . D • 1 アルギニン 9 . 7 1 0 尚、 N . D . は検出されないことを示す ( 1 1 ) C I Fの N端部ァ ミ ノ酸配列 精製 C I F溶液約 5 0 0.,ピコモル相当量を用いて、 気相 プロティ ンシークェンサ一 （'アプライ ドバイオシステムズ、 社製、 4 7 0 A型） にて、 C I Fの N末端より 4 5ァ ミ ノ 酸残基までの配列を決定した。 各反応サイ クルで得られる P T H—ア ミ ノ酸溶液は、 真空遠心乾固後、 3 3 %ァセ ト 二 ト リル水溶液に溶解させ、 P T H—ア ミ ノ酸分析用逆相 高速液体ク ロマ ト グラ フ ィ ー （ベッ クマ ン社製） にて分離 I口 j；>£した o 上記により決定されたァ ミ ノ酸配列は次の通りであった。
    [0205] Ala-Asp-Val-Lys-Asn-Phe-Tlir-Asp-Leu-Asp-Glu-Ala-Thr- L y s-Trp-Gly-Asn-Lys-Leu-Ile-Lys-Gln-Ala-Lys-Tyr-Ser- Ser-Asp-Asp-Lys-I le-Ala-Leu-Tyr-Glu-Tyr-T r-Lys-Asp- S e r-S e r-Ly s - 11 e -A s n-G 1 y 実施例 2
    [0206] ( 1 ) 黄色ブ ドウ球菌からの染色体 D N Aの調製 ト リ プチカ一ゼー ソイブロス （Trypticase-soybroth)斜 面培地 （Becton Dickinson and Co. , MD. USA 製） で継代培 養したスタ フ イ ロ コ ッ カス オー レウス E— 1
    [0207] (Stap¾ylococciis aureus E - 1 ) の一白金耳を、 T Y培 地 （ 1 %酵母エキス、 1. 7 % ト リプチ力一ゼ、 0. 5 % N a C 、 0. 2 5 % K 2 H P 04 ) 2 0 m l に接種し、 3 7 °Cで一晩振盪培養した後、 その全量を 5 0 0 m l の T Y培地に接種し、 3 7 °Cで更に一晩浸透培養した。 上記培養液を、 4 °Cにて 5 0 0 0 x g、 1 0分間遠心分 離し、 菌体を沈殿と して回収し、 次にこの菌体を 0. 1 M _ ト リ ス塩酸 （p H 7. 5 ) 、- 0. 1 M E D T A、
    [0208] 0. 1 5 M N a C ^からなる溶液で洗浄し、 4 °Cにて
    [0209] 2 5 0 0 X g、 1 0分間遠心分離を行って菌体を回収した。 上記で得られた菌体から、 マーマー [J, Marmin, J. Mol. Bio l. , 3, 208 ( 1961) ] の方法に従い、 下記のごと く染色 体 D Ν Αの調製を行った。 菌体に 4 0 m 1 の リ シス バッ フ ァ ー （Lys is buf f er ； 0. 0 1 M ト リ ス塩酸 （ p H 7. 0 ) 、 0. 0 1 M M g C 2 ^ 2. 5 M N a C ） を 添加して懸濁した後、 1. 7 m gの リ ゾスタフ イ ン
    [0210] (Lysostaphin シグマ社製） を添加し、 3 7 °Cにて 6 0分 間ィ ンキ.ュベー トを行い、 次いでこの溶菌液に 5. 3 2 ml の 2 5 % S D Sを添加して 3 7。Cにて 1 5分間ィ ンキュベ ー トを行った。 得られた溶液からフエノール · ク ロ口ホル ム抽出及びエタノール沈殿により D N Aを回収した。
    [0211] 得られた D N Aを 1 0 m l の 0. l x S S C ( 1 5 mM N a C 、 1. 5 mMクェン酸ナ ト リ ウム、 p H 7. 0 ) に溶解し、 続いて 0. 2 m l の 2 m g /m l R N a s e A (シグマ社製） を添加して 3 7。Cで 3 0分間イ ンキュべ一 卜 した。 上記の溶液からク ロ口ホルム · イ ソア ミ ルアルコ ール処理及びエタノール沈殿により D N Aを回収し、 次い で 1 8 m l の 0. 1 X S S Cに D N Aを溶解した。 この溶 液に 2 m l の 3 M酢酸ナ ト リ ウム緩衝液 （ p H 5. 0 ) 、
    [0212] 5 0 mM M g C ^ 2 からなる溶液を添加し、 次いで冷 ソプロパノール 2 0 m 1 を加えて D N Aを沈殿させてガラ ス棒に巻き取った後、 7 0 %エタノール中で 4 °Cでー晚静 置した。 この D N Aを乾燥後、 5 0 0 / 1 の T E ( 1 0 m M ト リ ス塩酸 （ p H 8. 0 ) 、 l mM E D T A) に溶 解して、 黄色ブ ドウ球菌染色体 D N Aと して用いた。
    [0213] ( 2 ) サザンブロ ッティ ングによる C I F遺伝子のスク リ 一二ング
    [0214] 上記で得た黄色ブドウ球菌染色体 D N A溶液から、 サザ ンの方法 [Southern, E. , Methods Enzymo 1, , 69, 152 ( 1980) ] に従い、 C I F遣伝子のスク リ ーニングを行った。
    [0215] まず、 黄色ブ ドウ球菌染色体 D N A 1 0 β gに制限酵素 E c o R I (宝酒造社製） の 5単位を加えて、 3 7でで
    [0216] 6 0分間ィ ンキュベー ト した後、 ァガロースゲル電気泳動 ¾r仃つた 0
    [0217] 泳動後のァガロースゲルを変性液 （ 0. 5 M N a 0 H, 1. 5 M N a C ^ ) に浸して 3 0分間振盪し、 次に中和 液 （ 0. 5 M ト リ ス塩酸 （ p H 7. 2 ) 、 1. 5 M
    [0218] N a C 、 1 mM E D T A) に浸し 1 5分間の振盪を 2 回行った。 次にこのゲルから、 2 0 X S S C ( 3 M N a C 、 0. 3 Mクェン酸ナ ト リ ウム、 p H 7. 0 ) 溶 液に浸しておいた二 トロセルロースメ ンブレンフィ ルター (A D V A N T E C社製） に、 一晩 D N Aの転写を行った 後、 フィ ルターを 8 0でにて 2時間処理するこ とにより、 D N Aをフィ ルター上に固定した。
    [0219] 次に、 黄色ブ ドウ球菌から実施例 1に従って精製 ， 単離 し、 同定した C I Fの N末端ア ミ ノ酸配列のうち、 10 A s p—16 G 1 yに相当する 2 0塩基の D N A、 即ち下 記式で示される 1 2 8通りの D N A混合物を、 D N A合成 機 3 8 1 A型 （アプライ ド バイオシステムズ社製） を用 いて合成し、 32Pで 5 ' 末端を標識してミ ッ クス ド · プロ ーブと した。
    [0220] A A C A C C A
    [0221] 5' -GAT GAG GCG ACG AAG TGG GG-3'
    [0222] T T 先に得られた二 トロセルロースメ ンブレンフィ ル夕一を、 プレハイブリダィゼーシ ヨ ン液 （蒸留水 9 m l、 2 0 X S S C 6 m l、 1 0 %N P— 4 0 l m l、 5 0 xデンハ ー ト （Denhardts ) 2 m l、 1 m gノ m 1 の子牛胸腺 D N A 2 m 1、 5 %ピロ リ ン酸ナ ト リ ウム 0. 2 m 1 ) に浸 して 6 5 °Cで 3時間ィ ンキュベー ト して前処置した後、 上記 5 ' 末端をラベルしたミ ッ クス ド ' プローブ （ I X 1 06 c p m) 及び 0. 2 M E D T A (p H 8. 0 ) 2 0 0 ^ 1 を加えて、 5 5 °Cでー晚ハイブリ ダィゼ一ショ ンを行つた。 ハイブリ ダイゼ一ショ ン後、 6 X S S C
    [0223] ( 0. 9 M N a C ^ , 9 0 mMクェン酸ナ ト リ ウム， p H 7. 0 ) — 0. 0 5 %ピロ リ ン酸ナ ト リ ウム混液にてフィ . ルターを洗浄し、 一 8 0 °Cにてー晚オー トラジオグラフィ 一を行った結果、 32P標識プローブと結合するフラグメ ン 卜が、 3. 5 k bの部分に出現し、 このフラ グメ ン ト中に C I Fの遺伝子が含まれることが示された。
    [0224] ( 3 ) C I F遺伝子のクローニング
    [0225] 次に C I F遺伝子を含む 3. 5 k b断片を、 以下に述べ るようにして、 p B R 3 2 8 [X. Soberon, L. Cova rrubi as, and F. Bolivar, Gene, 9, 287 ( 1980)] の E c o R I サイ ト にク ローニングした。
    [0226] 即ち、 前述のようにして得られた黄色ブ ドウ球菌染色体 D N A 2 0 // に制限酵素 E c o R I (宝酒造社製） の 1 0単位を加えて 3 7でで 1時間反応した後、 ァガロース ゲル電気泳動を行い、 C I F遣伝子を含む 3. 5 k bの E c o R I 断片を得た。 別にプラスミ ド p B R 3 2 8の 5 /z gに、 1 5単位の制限酵素 E c o R I を加えて、 3 7 °C で 3時間反応を行った。 得られた P B R 3 2 8の E c o R I 断片の 5 〃 gに、 マニアテイ スらの方法 [T. Maniatis e t a 1, , Molecular Clonin , p. 133, Cold S ring Har or Laboratory ( 1982) ] に従って、 アルカ リ ホスフ ァ タ一ゼ (ベ一 リ ンガー マンハイ ム社製， C I P ) を 1単位加え、
    [0227] 3 7 °Cで 3 0分反応した後、 再度アル力 リ ホスフ ァタ一ゼ -
    [0228] 1単位を加えて 3 7でで 1 5分反応を行った。
    [0229] 上記で得られた、 C I F遺伝子を含む約 3. 5 1^ 13の∑： c o R I 断片の 5 /z g と P B R 3 2 8の E c o R I 断片の .
    [0230] 5 を含む水溶液に、 1 0 ^ 1 の 1 0 X リガーゼ緩衝液 ( 6 6 0 mM ト リ ス塩酸 （ p H 7. 6 ) 、 6 6 mM
    [0231] M g C 2 、 l O O mMジチオス レイ ト一ル、 l O mM A T P ) 、 2 5 /z l の 4 0 %ポ リ エチ レ ングリ コール
    [0232] 6 0 0 0、 3 0 0単位の T 4 D N A リガ一ゼ （宝酒造社 製） を加えて 1 Ο Ο ί 1 と し、 1 6 °Cにて一晚反応を行つ
    [0233] /し O
    [0234] 次いで上記反応液を用いて、 大腸菌 W A 8 0 2株 [ B. Wood, J. Mol. Biol. , 16, 118 (1966)] を形質転換させた。 リ —デルベルグ （ Lede rbe rg)と コ一ェン （Cohen)の方法 [J. Bacteriol. , 119, 1072 ( 1974 )] に従って調製した WA 8 0 2株のコンビテン トセルの懸濁液 2 0 0 1 に、 上記リガ —ゼ反応液 1 0 0 〃 1 及び ト ラ ンスホーメ 一シヨ ン ノくッ フ ァ ー （ 8 %ポ リエチ レングリ コール 1 0 0 0、 I mM E D T A、 0. 2 M N a C 、 1 0 mM M O P S ) の 1 0 0 1 を加えて混合し、 6 0分間氷冷した後、 3 7 °C の水浴中で 5分間加温し、 これに L一ブロ ス （ 1 %パク ト ト リ プ ト ン、 0. 5 %酵母エキス、 0 , 5 %N a C ）
    [0235] 0. 5 m 1 を加えて更に 3 7'°Cで 6 0分間イ ンキュベー、 ト. した。 次いで得られた懸濁液 0. 9 m l を、 5枚の選択プ レー ト、 即ち l O O ^ g /m l のア ンピシ リ ンを含む L一 ブロ スに 1. 5 %寒天を添加して固めた平板培地 （ 2 5 ■ m l Zプレー ト） に 1 8 0 1 ずつ塗抹して、 3 7 °Cで一 晚培養した。
    [0236] 上記で得られた、 ア ンピシ リ ンを含む L平板培地上のコ ロニーを、 別のア ン ピシ リ ンを含む L平板培地、 及び - 1 0 0 β g /m 1 ク 口ラムフヱニコールを含む L平板培地 の両方にレプリ カ し、 3 7 °Cで一晩培養を行い、 ア ンピシ リ ンを含む L平板培地上で生育して、 ク ロラ ムフ ヱニコ ー ルを含む L平板培地上では生育しない、 ア ンピシ リ ン耐性 · ク ロラムフエ二コール感受性コロニー 3 2 0 0個をピッ クアップした。 次に、 こ の得られたコロニーについて、 先 に述べた32 P標識プローブを用いてマニアティ スの方法
    [0237] [ T. Ma n i a t i s e t a 1. , olecular Clonin , p 312, Cold
    [0238] S rin Ha r TO r L a b o I a t o r y ( 1982 ) ] に従ってコロニ一 ハイブリ ダィゼ一シ ヨ ンを行った結果、 このプローブと反 応する 3 5個のポジティ ブ ク ローンを得た。
    [0239] 更に上記で得られた 3 5個のコロニーから、 プラス ミ ド D N Aを単離し、 制限酵素 E c o R I (宝酒造社製） で切 断し、 サザンブロ ッティ ングにより解析した結果、 そのう ちの 1 8個のコロニーは、 32 P末端標識プローブと結合す ： る 3. 5 k bの E c o R I 断片を持っていた。 これらブラ ス ミ ドのうちの一つを. p E D N l 8 と命名した。
    [0240] ( 4 ) C I F遺伝子の D N A配列決定
    [0241] 次に、 上記で得られた p E D N 1 8の C I F翻訳領域に あたる全塩基配列を M 1 3 ファージを用いたサンガ一
    [0242] (Sanger) 法 [ Y a n i s h - P e r r。 n e t a 1. , G e n e, 33, 103 (1985 ) ] に従って決定した。 その結果は式 （ 2 ) に示した通りであ る o
    [0243] 式 （ 2 ) は 2 4 7個のア ミ ノ酸配列をコ一 ドする'翻訳領 域を含んでいる。 そのうちの一 3 5 (M e t ) 力ヽらー 1
    [0244] (A l a ) までの 3 5ァ ミ ノ酸配列は、 フ ォ ン ノヽイネ (Von Hei jne) の方法 [Nucl, Acids Res. , H, 4683 ( 1986) ] に従い、 分泌タ ンパクのシグナルペプチ ドであることが確 ゝ Iた。
    [0245] 更に上記ァ ミ ノ酸配列からシグナルべプチ ドのそれを除 いた 2 1 2個のア ミ ノ酸配列 （ C I Fのアミ ノ酸配列） は、 式 （ 1 ) に示すものであり、 その N末端部ア ミ ノ酸配列は、 実施例 1 において決定した天然型 C I Fの N末端部ア ミ ノ 酸配列と完全に一致し、 式 （ 2 ) に示された塩基配列は C I Fをコー ドしていることが確認された。
    [0246] 実施例 3
    [0247] ( 1 ) α —ア ミ ラーゼ プロモーター配列合成及びク ロ. —ニング
    [0248] C I Fの組換えのために、 まず下記式 （ 3 ) に示される ノ チノレス リ ケニフ ォ 一 ミ ス (B a c i j I u s 1 i c h e n i f o rm i s) © α —ア ミ ラーゼ遺伝子のプロモーター [Stephens et a !. , J. Bact er i ol. , 369 ( 1984 )] を含む D N A断片を化 学的に合成した。
    [0249] 式 （ 3 ) ：
    [0250] X b a I E N - 5 E N— 6
    [0251] E N - 1 0
    [0252] E N - 7
    [0253] CGGAATATTTATA
    [0254] ( E c o R I )
    [0255] GTTATAGTATACTTAA. より詳しく は、 E N— 5、 E N— 6、 E N— 7、 E N— 8、 E N — 9及び E N — 1 0の 6種の D N A断片を、 D N A合成機 3 8 1 A型 （アプライ ド バイオシステム社製） を用いてそれぞれ合成した。 次いで、 T 4 ポ リ ヌ ク レオチ ドキナーゼ （宝酒造社製） で 5 ' 末端をリ ン酸化した E N — 6、 E N— 7、 E N— 9及び E N— 1 0 と リ ン酸化して いない E N— 5及び E N— 8とを各々 l 〃 g混合し、 T 4 D N Aリ ガ一ゼを用いてこれらを連結し、 式 （ 3 ) で表わ される約 1 1 2 b pの α—ア ミ ラーゼ遣伝子のプロモ一夕 一 D N Α断片を調製した。
    [0256] 一方、 プラ ス ミ ド p K K O l (微ェ研寄託番号 F E RM B P— 9 0 1 ) 5 gを制限酵素 E c 0 R Iで切断し、 約 5. 7 5 k bの D N A断片を調製した。
    [0257] 上記で得られた約 1 1 2 b pの な一ア ミ ラーゼ遣伝子の プロモーター D NA断片と約 5. 7 5 k bの D N A断片を T 4 D N A リガーゼにより桔合反応させた。 この反応液を 用いて、 前記の リ ーデルベルグとコ一ェンの方法により、 大腸菌 H B 1 0 1株 [H. W, Boyer , D. Roul 1 a n d -D u s s o i x, J. Mol. Biol. , , 459 (1969)]の形質転換を行った。 ア ン ピシ リ ン 1 O O /z gZmlを含有する L—ブロス （バタ ト ト リ プ ト ン 1 0 g/1 、 パク トイ 一ス ト抽出物 5 g/1 、
    [0258] N a C ^ 0. 5 g/l の 1. 5 %寒天を添加して固化した平 板培地 （2 5 ml/ プレー 卜） 上に、 上記で得られた形質転 換体を含む懸濁液を塗抹して、 3 7 °Cで一晩培養した。
    [0259] 上記平板培地からァン ピシリ ン耐性を示す形質転換体を 1株選択し、 該形質転換体から、 プラス ミ ド D N Aを単離 し、 p HM 0 4 と命名した。
    [0260] プラス ミ ド p HM 0 4は、 ァガロースゲル電気泳動法か ら大きさが約 5. 7 6 k bであり、 第 3図に示すように、 . アンピシリ ン耐性遣伝子の上流に α—ア ミ ラーゼプロモ一 ターを有し、 更に大腸菌及び枯草菌の複製開始領域を有す る構造のものであるこ とがわかった。 .
    [0261] ( 2 ) C I F発現べク タ一の調製
    [0262] C I F前駆体の遺伝子は、 式 （ 2 ) に示すよ うに、 制限 酵素 S s p iを用いて、 C I F前駆体遺伝子を有するブラ ス ミ ド p E D N 1 8から切り出すことができる。
    [0263] まず、 p E D N 1 8 1 0 ^ gに制限酵素 S s p I (宝 酒造社製） 6単位を加えて、 3 7 ^で 3時間反応を行い、 C I F前駆体遣伝子を含む約 8 6 5 b pの D N A断片を調 製した。
    [0264] 別に、 プラス ミ ド p U C 1 9 (宝酒造社製） 1 gに制 限酵素 H i n C n (宝酒造社製） 1 0単位を加え、 3 7 °C で 3時間反応を行い、 約 2. 7 k bのべクタ一 D N A断片 を調製した。
    [0265] 上記で得られた C I F前駆体遺伝子を含む約 8 6 5 b p の D N A断片と約 2. 7 k bのべクタ一 D N A断片とを
    [0266] T 4 D N A リガ一ゼにより連結させた。 この反応溶液で大 腸菌 J M 1 0 9株 （宝酒造社製） をリ ーデルベルグとコ一 ェンの方法により形質転換して、 上記と同様にして、 ア ン ピシリ ン添加 （ 1 0 0 n g /ml) の平板培地上に得ら.れた アンピシリ ン耐性を示す形質転換体の 1株を選び、 この' '形' 質転換体からプラスミ ド D N Aを単離し、 p HM 0 3 と命 ■¾しナし o
    [0267] プラス ミ ド p H M 0 3は、 ァガロースゲル電気泳動法'か ' ら大きさが約 3. 5 5 k bであり、 第 3図に示すように、 C I F遺伝子前駆体がベク ター p U C l 9に挿入された構 造を有し、 ∑ じ 01 1及び？ 5 t I の 2種の制限酵素で切 断する こ とによ り C I F前駆体遺伝子を再び切り出すこ と ができることがわかった。
    [0268] 次いで、 高塩濃度緩衝液 （ 5 0 mM ト リ ス塩酸 （ p H 7. 5 ) 、 1 0 0 mMN a C 、 1 0 mMM g C 2 、 1 mMジ チオスレィ トール） 中で、 上記で得られた p MH 0 3
    [0269] 1 0 gを制限酵素 E c 0 R I及び P s t I (宝酒造社製） と共に 3 7 °Cで 3時間反応させて切断し、 C I F前駆体遗 伝子を含む約 0. 9 k bの D N A断片を調製した。 また、 p H M 0 4 5 gを同様に E c 0 R I及び P s t Iで切 断し、 約 5. O l k bのベクター D N A断片を調製した。 得られたこれら 2種の D N A断片の混合物の水溶液に T 4 D N A リガーゼ 3 5 0単位を添加して、 これらの D N A断 片を連結させた。 この反応溶液で大腸菌 H B 1 0 1株をリ —デルベルグとコーェ ンの方法により形質転換して、 上記 と同様にして、 カナマイ シ ン添加 （ 5 /z g Zml) の平板培 地上に得られたカナマイ シ ン耐性を示す形質転換体の Γ株 - を選び、 この形質転換体からプラス ミ ド D N Aを単離し、p E D K 7 と命名した。
    [0270] プラ ス ミ ド p E D K 7は、 ァガロ ースゲル電気泳動法か- ら大きさが約 5. 9 1 k bであり、 第 3図に示すように、 α一ア ミ ラーゼ プロモーターの下流に C I F前駆体遺伝 子を有し、 更に大腸菌及び枯草菌の複製開始領域並びに力 ナマイ シン耐性遺伝子を有する構造のものであるこ とがわ
    [0271] »ヽつ ： Γこ 0
    [0272] この様にして得られたプラス ミ ド P E D K 7を用いて、 枯草菌 I A 1 8 2株を形質転換した。 枯草菌 I A 1 8 2株 [Y 0 n e d a Y. e t a 1. , Biochem. Biophys. Res. Commu π . , 50, T 65 ( 1973)] は、 公共の菌株保存機関であるオハイオ 州立大学のバチルスジエネティ ッ クス ト ッ クセンターから 入手した。
    [0273] 枯草菌の形質転換は、 リ ゾチーム処理によりプロ トプラ ス ト化した枯草菌を用いて実施した。 詳しく は、 枯草菌 I A 1 8 2株を、 L B培地中で、 3 0 °Cにて一晩前培養した。 L B培地 5 O mlに前媒養液 l nilを接種して、 3 0。Cで 3時 間振盪培養した。 培養液を 5分間遠心分離して （ 7 0 0 0 rpm/分） 、 集菌し、 これを S MM P溶液 （ 0. 5 Mシ ョ糖、 2 0 mMマレイ ン酸ナ ト リ ウム （ p H 6. 5 ) 、 2 0 mMM g C ^ 2 、 0. 3 5 %ペンア ツセィ ブロース （ディ フ コ社製） ) 5 m 1に懸濁した。 この懸濁液に リ ゾチーム （シグマケ ミ カル社製） 1 0 mgを加え、 3 7 °Cにて 1 時間保温した。
    [0274] 9 0 %以上の細胞がプロ トプラス 卜化したこ とを顕微鏡下 に確認した後、 遠心分離 （ 3 0 0 0 rpm/分 x 5分間） によ り集菌し、 これを S MM P溶液 5 mlで 1回洗浄した後、 S MM P溶液 5 mlに懸濁した。 この懸濁液 0. 5 mlとプラ ス ミ ド p E D K 7 1 0 gを含む水溶液 0. 1 mlとを混合 して、 ポ リ エチレングリ コール溶液 （4 0 %ポ リ エチ レ ン グリ コール 6 0 0 0 (和光純薬株式会社製） 、 0. 5 Mシ ョ糖、 2 0 mMマレイ ン酸ナ ト リ ウム （ p H 6. 5 ) 、 2 0 mMM g C £ 2 ) 1. 4 mlを加えて、 上下に 2分間攪拌した。 この混合物に S MM P溶液 5 mlを加え、 遠心分離
    [0275] ( 3 0 0 0 rpm/分 X 1 5分間） して、 得られたプロ 卜ブラ ス トを S MM P溶液 1 mlに懸濁し、 3 0 °Cで 9 0分間静置 した。 懸濁液を S MM P溶液で 1 0〜 1 0 0 0倍希釈した 後、 その 0. 2 mlを下記に示す組成の D M 3培地上に塗抹 し、 3 0 °Cで 2 4時間培養して、 生育した枯草菌を形質転 換体と して単離した。
    [0276] く D M 3培地の組成 > コハク酸ナ ト リ ウム 1 3 5 . 1 g / β カザ ミ ノ酸 5. 0
    [0277] パク トイース ト抽出物 5 . 0
    [0278] ブ ドウ糖 5 0
    [0279] リ ン酸一カ リ ウム 5
    [0280] リ ン酸ニ力 リ ウム 3 5
    [0281] 塩化マグネシゥム 4
    [0282] ゥ シ血清アルブ ミ ン 0 1
    [0283] 寒天 8 0
    [0284] カナマイ シ ン硫酸塩 0 3
    [0285] この様にして得られたプラス ミ ド P E D K 7を保有する 枯草菌 I A 1 8 2は、 Γ Ι Α 1 8 2 [ p E D K 7 ] 」 なる 表示で、 通産省工業技術院微生物工業研究所に寄託されて いる。 寄託番号は、 F E R M B P — 3 0 2 5である。
    [0286] このプラ スミ ド P E D K 7を保有する枯草菌 I A 1 8 2 株は、 5 ジャ ーフ ア ーメ ンター （M D 3 0 0 — 5 L型、 丸菱バイオェンジ社製） において、 ソィ ト ン リ ン培地 （バ ク ト ソィ ト ン 2 0 g/l 、 ブ ドウ糖 2 g/l 、 N a C ^ 5 g/l N a 2 H P 04 2. 5 g/1 、 H 7. 3 ) 3 ^ 中で、 3 0 でで培養し、 1 0、 1 1 . 5及び 1 3時間後にそれぞれ約 1 0 miの培養液を採取し、 遠心分離により培養上澄を調製 した。 ( 3 ) E L I S Aによる C I Fの定量
    [0287] 上記 （ 2 ) で得られた各培養上澄について、 E L I S A 法で C I Fの存在を確認した。
    [0288] a ) 抗 C I F血清の調製
    [0289] 精製 C I F (以下標準 C I F) を抗原と して、 家兎を免 疫し、 C I F抗体を含む抗血清 E D N— 0 0 1を作成した。 詳しく は、 標準 C I F 8 0 // gを含む 5 0 mMリ ン酸緩衝液 ( p H 6. 9 ) 0. 4 mlにコ ンプリ ー トフ ロイ ン ドア ジュ バン ト （ディ フコ社製） 0. 4 mlを加えて乳化し、 これを 家兎の胸部に皮下注射した。 この操作を 2週間毎に 4回繰 り返した後、 標準 C I F 8 0 ^ gを更に静脈内注射し、 3 曰後に全血を採取し、 血清を分離した。
    [0290] b ) 抗 C I F - I g G及び酵素標識抗体の調製
    [0291] M A P S Πキッ ト （バイオラ ド社製） を用いて、 上記 a ) で得た抗血清 E D N— 0 0 1 1 0 miから I g G 9 1. 2 mgを精製した。 このうち半量を 1 0 O mMリ ン酸緩衝液 （p H 7. 0 ) に対して透析した後、 分注保存してコーティ ン グ用 I g Gと した。 次いで、 I g G 3 7. 5 mgを含有する 1 0 O mM酢酸ナ ト リ ゥム緩衝液 （p H 4. 5 ) に、 ぺプシ ン 1. 5 mgを加え 3 7 °Cで 4 8時間反応させた後、 0. 1 N水酸化ナ ト リ ウムで p H 7. 0に調整し、 A c A 4 4力 ラム （ 1. 5 x 4 5 cm、 I B Fバイオテクニク ス社製） に かけて、 l O O mMリ ン酸緩衝液 （ p H 7. 0 ) で溶出した。 得られた F ( a b ' ) 2 1 8. 5 mgを含有する 1 0 0 mMリ ン酸緩衝液 （p H 6. 0 ) 6 mlに、 1 0 0 mM2 —メ ル プ 卜エタノ ールと l mME D T Aを含む 1 0 O mMリ ン酸緩衝液 ( p H 6. 0 ) 6 6 6 / ^ を加えて、 3 7 °Cで 9 0分間反 応させた。 次いで、 上記反応液をセフ アデッ クス G— 7 5 カラム （ 1. 5 x 4 5 cm) で精製して、 F a b ' 1 7 mgを 得た。
    [0292] 別にホースラディ ッ シュパ一ォキシダ一ゼ （以下 P 0 D、 東洋紡製） 2 7. 5 を含む 1 0 0 mMリ ン酸緩衝液 （ p H 7. 0 ) 1. 9 mlに、 8 0 mMN— （ ε —マ レイ ミ ドカプロ イ ロキシ） ースク シンイ ミ ドを含むジメ チルホルムア ミ ド 0. 2 mlを加えて、 3 7 °Cで 3 0分間反応させた。 次いで、 セフ アデッ ク ス G— 7 5 カラム （ 1. 5 x 4 5 cm) で精製 することにより、 マレイ ミ ド基を導入した P O D (以下 P O D— mal ) 1 9 mgを得た。
    [0293] 得られた F a b ' 3 mgと P O D—mal 5. 4 mgとを混合 し、 4 °Cにて 2 3時間反応させた。 5 0 mMN—ェチルマレ イ ミ ド 1 2 を加えた後、 A c A 4 4カラム （ 1. 5 x 4 5 cm) によ り精製し、 酵素標識抗体 （以下 F a b ' - P 0 D ) 1. 2 mgを得た。 得られた F a b ' — P O Dに、 0. 5 %牛血清アルブミ ン （以下 B S A、 シグマケ ミ カル 社製） 、 0. 0 5 %チメ ロサール及び 1 0 %正常家兎血清 を加えて、 分注し、 凍結保存した。
    [0294] c ) C I Fの定量，
    [0295] 上記で得られたコ一ティ ング用 I g Gをリ ン酸塩緩衝生 理食塩水 （P B S ) で 2 0 ^ g/mlになるように希釈し、 希釈液を 9 6ゥヱル—マイ ク ロプレー ト （ヌ ンク社製） > . 各ゥヱルに 1 0 0 ずつ注ぎ、 4 °Cでー晚静置した。 次 いで、 このプレー トを流水で洗浄した後、 1 % B S Aを含 む P B Sを 3 0 0 ずつ各ゥヱルに加えて、 4でで一晩 静置した。 次いで、 各ゥエルを 0. 0 5 %ポ リオキシェチ レン （2 0 ) ソルビタ ンモノ ラ ウ レー ト （和光純薬工業製） 添加 P B Sで洗浄した後、 0. 1 % B S Aを含む P B Sで 希釈した標準 C I Fまたは検体を 1 0 0 // ずつ各ゥエル に加えて、 4 Cでー晚静置した。 その後、 各ゥエル内の液 体を除去し、 0. 0 5 % T w e e n 2 0添加 P B Sで洗浄 し、 次いで 0. 1 % B S A添加 P B Sで 1 0 0倍希釈した F a b' — P O Dを 1 0 0 〃 ずっ各ゥエルに加えて、 室 温で 4時間静置させた。 各ゥエル内の液体を再び除去し、 0. 0 5 %T e e n 2 0添加 P B Sで洗浄し、 更に P B Sで洗浄した後、 0. 2 5 % o—フ エ二レ ンジァ ミ ンと 0. 1 5 %過酸化水素水とを含有する 1 0 O mMクェン酸— リ ン酸緩衝液 （P H 5. 0 ) を 1 0 0 / ずつ各ゥエルに 添加した。 室温で 1 5分間反応させ、 最後に 1 N硫酸 1 0 0 ずつを各ゥヱルに加えた。
    [0296] 4 9 2 nmの吸光度を測定して得られた標準 C I Fの希釈 曲線から検体中の C I F含量を求めた。 測定結果を下記に 示す。
    [0297] 培養時間 （時間） 10 11. 5 13
    [0298] C I F含量 （mg/ ί ) 8. 1 11. 1 21. 3 上記の結果から、 プラス ミ ド p E D Κ 7を保有する枯草 菌 I A 1 8 3株の培養上清中に相当量の C I Fが産生され ているこ とが明らかであり、 且つこの培養上清から精製単 離された C I F は、 スタ フ イ ロ コ ッ カス オー レウス Ε - 1が産生する C I F (天然型） と物理化学的及び免疫化学 的に同一のものであった。
    权利要求:
    Claims

    請 求 の 範 囲 1. 下式 （ 1 ) で表わされる 2 1 2個のア ミ ノ酸配列を有 し、 S D S— P A G Eから求めた分子量が約 2 4 0.0 0 - ダル ト ンであるこ とを特徴とするポ リべプチ ド。 式 （ 1 ) ：
    I 10
    A 1 a Asp V a 1 L y s A s n P h e Th r Asp L e u Asp
    II 20
    G 1 II Ala Th r Lys T r p Gly A s n L y s Leu l ie
    21 30
    Lys Gin A 1 a Lys T y r S e r S e r Asp Asp L y s
    31 40
    l ie Ala Leu Ty r G 1 u Ty r Th r L y s Asp S e r
    41 50
    8 e r Lys I 1 e A s n Gly Pro L e i] A r g Leu Ala - 51 60 .
    Gly G 1 Asp 11 e A s n I y s Leu Asp S e r Th r
    61 70
    Th r Gin As p Ly s Va 1 A r g A r g Leu As S e r
    71 80
    S e r l ie S e r Lys Ser Th r T h r Pro G 1 u S e r
    81 90
    V a 1 Ty r V a 1 Ty r A r g L e u L e u A s n L e u Asp
    91 100
    Ty r Leu Th r Ser l ie Va 1 G 1 y P e Th r As n
    101 110
    G 1 u A s p Leu Ty r Lys Leu G 1 n Gin Th r A s n HI 120
    As n G 1 Gin Ty r As G 1 u A s n Leu Va 1 A r g
    121 130
    L y s Leu A s n A s n V a 1 Met A s n Ser A r g l ie
    131 140 '
    Ty r Arg Glu Asp Gly Ty r Ser Ser Thr Gin
    141 150
    Leu Va I Ser Gly Ala Ala Ya 1 Gl Gl Arg ：. ,
    151 160 '
    Pro l ie Glu L e u Arg Leu Glu L e u Pro L y s
    HI Π0
    Gly Thr Ly s Ala Ala Tyr Leu A s n Ser Ly s
    1Π 180
    As Leu Thr A i a Tyr Tyr G 1 y Gin Gin Glu
    181 190
    Va 1 Leu Leu Pro Arg Gly Thr Glu Tyr A I a
    191 200
    Ya I G 1 Ser Ya 1 Glu Leu Ser A s n Asp L"
    201 210
    Ly s Ly s l ie l ie l ie Thr Ala l ie Va 1 Ph e
    211 212
    L y s L y s
    2. 請求項 1に記載めア ミ ノ酸配列をコー ドする D N A配 列。
    3. 下記式で表わされる請求項 2に記載の D N A配列。 GCT GAT GTT AAA AAT TTC ACT GAT TTA GAT
    GAG GCA ACT AAA TGG GGG AAT AAA CTT ATA
    AAA CAA GCT AAG TAT AGT TCG GAT GAT AAA
    ATA GCT CTA TAC GAA TAT ACA AAA GAT AGT
    TCT AAG ATA AAT GGT CCA TTA AGA CTC GCA
    GGT G6A GAT ATT AAT AAG CTA GAT TCA ACA
    ACT CAA GAC AAA GTA AGA AGA TTA GAT TCA
    TCT ATT TCT AAA TCT ACT ACT CCT GAA TCT
    GTA TAC GTT TAT AGA CTT TTA AAT TTA GAT
    TAT TTG ACA AGT ATC GTT GGA TTT ACA AAT
    GAA GAT TTA TAT AAA TTA CAA CAG ACC AAT
    AAT GGC CAG TAT GAT GAA AAT CTA GTT AGA
    AAG CTT AAT AAC GTT ATG AAT AGC AGA ATA
    TAT AGA GAA GAC GGA TAC TCT AGT ACA CAA
    TTA GTT AGT GGA GCA GCT GTA GGT GGT AGA
    CCT ATT GAA TTA AGG TTA GAA TTA CCA AAA
    GGG ACT AAA GCT GCG TAT CTT AAT TCT AAA
    GAT TTA ACT GCT TAC TAT GGT CAA CAA GAA
    GTT TTA TTA CCT AGA GGC ACA GAA TAC GCT
    GTT GGA AGT GTA GAA TTG TCA AAT GAT AAA
    AAG AAA ATC ATA ATA ACA GCT ATT GTT TTT AAA AAA
    4. 請求項 1に記載のア ミ ノ酸配列をコー ドする D N A配 列を有する発現ベクター。
    5. 請求項 1に記載のポリ プチ ドとシグナルべプチ ドとの 融合タ ンパク質のア ミ ノ酸をコー ドする D N A配列。
    6. 下記式で表わされる請求項 5に記載の D N A配列。 ATG AAA AAC AAA TTA CTT TTT AAA ATT TTT
    Met L y s A s n L y s L e u L e u P h e L y s l ie P li e -35 -26
    TTG AGT TTA TCT TTA GCA TTA AGC GTT TAT
    Leu S e r Leu S e r L e u A 1 a Leu 8 e r Va 1 Tyr
    -25 -16
    TCA ATT AAT GAT AAA ATC ATA GAA GTA TCT
    5 e r I 1 e A s n A s p L y s I 1 e l ie G 1 u V a 1 S e r -15 -6
    AAT ACT TCT TTA GCA GCT GAT GTT AAA AAT
    A s n Th r S e r L e u A 1 a Ala Asp V a 1 L y s A s n
    -5 -1 1 5
    TTC ACT GAT TTA GAT GAG GCA ACT AAA TGG
    P h e Th r Asp L e u Asp G 1 u Ala Th r L y s T r p
    6 15
    GGG AAT AAA CTT ATA AAA CAA GCT AAG TAT
    G I A s n L y s Leu I 1 e Lys Gin Ala Lys Tyr
    16 25
    AGT TCG GAT GAT AAA- ATA GCT CTA TAC GAA
    S e r S e r Asp As p L y s I 1 e Ala Leu Tyr G I u
    26 35
    TAT ACA AAA GAT AGT TCT AAG ATA AAT GGT
    Tyr Thr Lys Asp 8 e r 8 e r Lys I 1 e A s n G 1 y 36 45 CCA TTA AGA CTC GCA GGT GGA GAT ATT AAT
    Pro Leu A r g Leu A 1 a G 1 y Gly Asp I 1 e A s n
    46 55
    AAG CTA GAT TCA'ACA ACT CAA GAC AAA GTA
    L y s Leu Asp S e r T r Th r Gin Asp Ly s Va I
    56 65
    AGA AGA TTA GAT TCA TCT ATT TCT AAA TCT
    A r g A r g Leu As S e r S e r lie S e r Ly s S e r
    66 75
    ACT ACT CCT GAA TCT GTA TAC GTT TAT AGA
    Thr Thr Pro Gl u Se r Va 1 Ty r Ya 1 Ty r Arg
    76 85
    CTT TTA AAT TTA GAT TAT TTG ACA AGT ATC
    Leu Leu A s n Leu Asp Tyr Leu Thr S e r lie
    86 95
    GTT GGA TTT ACA AAT GAA GAT TTA TAT AAA
    Ya 1 G 1 y P e Thr A s n G 1 u Asp Leu Ty r Ly s
    96 105
    TTA CAA CAG ACC AAT AAT GGC CAG TAT GAT
    Leu Gin Gin Til r Asn Asn Gly Gin Tyr Asp
    106 115
    GAA AAT CTA GTT AGA AAG CTT AAT AAC GTT
    Glu Asn L e u Va 1 Arg L y s L e u As n Asn V a 1 ATG AAT AGC AGA ATA TAT AGA GAA GAC GGA
    Met As n S e r A r l ie Ty r A r g G 1 u Asp G 1 y
    126 135
    TAC TCT AGT ACA CAA TTA GTT AGT GGA GCA ·
    Ty r Se r 3e r T r Gin Leu Ya 1 Se r G I y A 1 a
    136 145
    GCT GTA GGT GGT AGA CCT ATT GAA TTA AGG
    A I a Va I G I y G 1 Ar g Pro lie Gl u Leu Ar g
    146 155
    TTA GAA TTA CCA AAA GGG ACT AAA GCT GCG
    Leu G 1 u Leu Pro L y s G 1 y T h r L y s A！ a A 1 a "
    156 H5
    TAT CTT AAT TCT AAA GAT TTA ACT GCT TAC
    Ty r L e u A s n 8 e r L y s A s p Leu Th r Ala Ty r
    166 175
    TAT GGT CAA CAA GAA GTT TTA TTA CCT AGA
    Ty r Gl y Gin Gin G 1 u Va 1 Leu Leu Pro Arg
    Π6 185
    GGC ACA GAA TAC GCT GTT GGA AGT GTA GAA
    Gly Thr Glu Tyr Ala Val Gly Ser Val Glu
    186 195
    TTG TCA AAT GAT AAA AAG AAA ATC ATA ATA
    Leu Ser A s n As p L y s L y s Lys lie I 1 e l ie ACA GCT ATT GTT TTT AAA AAA TAG
    Thr A 1 a 11 e Ya 1 Phe Lys Ly s 本本本
    206 212
    7. 請求項 5または 6に記載の D N A配列を有する発現べ : ' クタ一。
    8. 請求項 4または 7.に記載の発現ベクターを保有する形 質転換体。
    9. 宿主が原核生物である請求項 8に記載の形質転換体。
    10. 宿主が大腸菌または枯草菌である請求項 8に記載の形
    質転換体。
    11. 微ェ研究条寄第 3 0 2 5号 （F E RM B P— 3 0 2 5 ) である請求項 1 0に記載の形質転換体。
    12. 請求項 1に記載のポリベプチ ドの製造方法であって、
    式 （ 1 ) のア ミ ノ酸配列をコー ドする D N A配列を有す る発現ベクターを保持する形質転換体を、 目的とするポ リベプチ ドを発現できる条件下で培養し、 培養物から該 ポリべプチ ドを単離することを特徵とするポリべプチ ド の製造方法。
    13. 請求項 1に記載のポリペプチ ドを有効成分とすること
    を特徵とする医薬組成物。
    14. 皮膚角質化抑制剤である請求項 1 3に記載の医薬組成
    物。
    15. 請求項 1に記載のポリペプチ ドを含有する化粧料。
    6. 請求項 1に記載のポリペプチ ドの有効量を用いて皮膚 角質化異常に関連する皮; S疾患症状を予防または治療す る方法 o
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    JP1/230703||1989-09-05||
    JP23070389||1989-09-05||DE69029259T| DE69029259D1|1989-09-05|1990-09-05|Polypeptid, dessen herstellung, und dieses polypeptid enthaltende pharmazeutische verbindungen und kosmetika|
    EP90913246A| EP0446361B1|1989-09-05|1990-09-05|Polypeptide, production thereof, and pharmaceutical composition and cosmetic containing said polypeptide|
    US08/353,341| US5654171A|1989-09-05|1994-12-05|Polypeptide, process for preparing the same and pharmaceutical compositions and cosmetics containing the polypeptide|
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